(Người Chăn Nuôi) – Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho sản xuất chế phẩm probiotic định hướng thay thế kháng sinh trên gia cầm từ các chủng Lactiplantibacillus. Nghiên cứu do Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế và Trường Đại học Tây Nguyên thực hiện.
Số lượng chủng Lactiplantibacillus được phân lập từ phân gà là 68, trong đó có 5 chủng kháng khuẩn tốt nhất chống lại vi khuẩn gây bệnh trên gà (Escherichia coli FG31-1, Salmonella typhimurium FC13827 và Proteus mirabilis MPE4069) đã được lựa chọn và đánh giá về tính an toàn. Bốn chủng (L. plantarum L3, L. plantarum L8, L. acidophilus L18, và L. agilis L27) được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau, trong đó môi trường Mgl (chứa glucose) và Mlac (bột sữa gầy) cho sinh trưởng tốt nhất. Thử nghiệm lên men bán công nghiệp với các chủng này xác định tốc độ khuấy tối ưu là 50 vòng/phút, đạt sinh khối 0,6 g/L.
Lựa chọn chủng Lactiplantibacillus
Chủng Lactiplantibacillus được phân lập từ nguồn gà bản địa tại Thừa Thiên Huế và được kiểm tra khả năng kháng khuẩn đối với những vi khuẩn đã được phân lập từ những gà bản địa bị tiêu chảy.
Với mục tiêu tìm chủng vi khuẩn tiềm năng thay thế kháng sinh, việc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn tyhphimurium FC13827 và Proteus mirabilis MPE4069 gây bệnh đường tiêu hóa trên gà được thử nghiệm với 67 chủng Lactiplantibacillus được phân lập. Kết quả đã chọn ra được 13 chủng Lactiplantibacillus (19,41%) có hoạt động ức chế chống lại ít nhất 2 trong 3 mầm bệnh (ĐK ≥ 10 mm). Còn lại, 11 chủng (16,42%) có thể ức chế được 1 trong 3 mầm bệnh và 43 chủng (64,17%) không ức chế được mầm bệnh nào (dữ liệu không hiển thị). Nhìn chung, đối với cả 3 chủng vi khuẩn gây bệnh, 5 chủng Lactiplantibacillus (L3, L8, L27, L18 và L36) có khả năng kháng khuẩn trung bình (14,11 – 17,89 mm) cao hơn có ý nghĩa thống kê so với 8 chủng còn lại (8,21 – 12,33 mm).
Như vậy, kết quả trên cho thấy chủng Lactiplantibacillus phân lập từ gà bản địa có khả năng chống lại một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ những gà bản địa bị bệnh tiêu chảy. Hoạt động này, cùng với cơ chế loại trừ cạnh tranh, trong đó các chủng lợi khuẩn cạnh tranh với mầm bệnh để lấy chất dinh dưỡng và vị trí gắn kết, ngăn chặn mầm bệnh xâm nhập vào ruột.
Đánh giá tính an toàn của các chủng Lactiplantibacillus được lựa chọn
Hoạt động dung huyết
Vi khuẩn dương tính với dung huyết được xem là không an toàn để sử dụng làm chế phẩm sinh học do độc lực của chúng gây phù nề và thiếu máu. Hemolysin do mầm bệnh tạo ra được cho là có tác dụng ly giải tế bào vật chủ để giải phóng các hợp chất chứa sắt như huyết sắc tố, có lợi cho sự phát triển của vi khuẩn có hại trong cơ thể vật chủ (Elliott et al., 1998). Trong khi kết quả xét nghiệm dung huyết β được xem là có hại, thì dung huyết γ và α được coi là an toàn. Trong nghiên cứu này, tất cả các chủng đều biểu hiện dung huyết α, biểu hiện an toàn.
Khả năng kháng kháng sinh
Sự an toàn của chủng vi sinh đã nhận được sự chú ý ngày càng tăng do khả năng chuyển giao và lan truyền các gen kháng kháng sinh giữa các vi sinh vật (Campedelli et al., 2019). Do đó, sự vắng mặt của các gen mã hóa kháng kháng sinh là lựa chọn quan trọng để đảm bảo an toàn cho chế phẩm vi sinh.
Trong nghiên cứu này, chủng L3 và L27 đã kháng (R) với vancomycin, trong khi các chủng khác thì ở mức nhạy (IS). Đối với các kháng sinh còn lại, mức độ khác của các chủng Lactiplantibacillus ở mức trung bình (IS) hoặc nhạy (S). Tuy nhiên, theo một số tác giả, khả năng kháng vancomycin của Lactiplantibacillus sẽ không được truyền sang vi khuẩn gây bệnh vì đây là một đặc điểm nội tại, được mã hóa bởi các gen nhiễm sắc thể (Gueimonde et al., 2013a) và sự thay thế đầu cuối d -alanine bằng d -lactate hoặc d -serine trong muramyl-pentapeptide ngăn chặn sự gắn kết của vancomycin (Lee et al., 2001). Như vậy, các chủng Lactiplantibacillus được lựa chọn đều an toàn và được sử dụng cho các thử nghiệm tiếp theo.
Tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng cho Lactiplantibacillus được chọn
Các thí nghiệm sơ bộ để tối ưu hóa sản xuất quy mô lớn là cần thiết để cung cấp số lượng lớn vi khuẩn sống probiotic cho vật nuôi đã được thực hiện. Sản xuất quy mô lớn và chi phí thấp các loại vi khuẩn này đang trở thành một vấn đề quan trọng. Do đó, khả năng sản xuất số lượng lớn tế bào, các thông số sinh trưởng và việc sử dụng các thành phần môi trường chi phí thấp nên được xem xét để tối ưu hóa môi trường tăng trưởng. Việc lựa chọn các chủng vi khuẩn tiềm năng thay thế kháng sinh trong phòng trị bệnh tiêu chảy ở gà dựa trên khả năng kháng khuẩn để áp dụng làm probiotic đã được thực hiện trước đó cùng với các đặc điểm an toàn cho phép.
Bốn chủng vi khuẩn (L. plantarum L3, L. plantarum L8, L. acidophilus L18, và L. agilis L27) được chọn để sàng lọc sơ bộ các điều kiện nuôi cấy tối ưu để tạo ra khối lượng tế bào cao. Với mục đích này, 5 môi trường khác nhau bao gồm một số nguồn nitơ (sữa tách kem, protein cô đặc hòa tan từ váng sữa, peptone casein, chiết xuất nấm men) và carbon (glucose, lactose) đã được thử nghiệm. Kết quả cho thấy sự phát triển của vi khuẩn Lactiplantibacillus vào thành phần của các môi trường nuôi cấy.
Động học khác nhau được hiển thị khi đo cả OD và số lượng CFU/mL. Khi xác định OD560 max trong môi trường trong suốt (Mpep, Mgl, MRSc và MRS), L. plantarum 1582, L. plantarum JDM1, L. acidophilus NCFM không thể phát triển trong môi trường Mpep có chứa peptone, trong khi L. agilis DSM 20509 lại có sự phát triển ít. Sự phát triển tốt hơn được tìm thấy đối với cả bốn loại vi khuẩn Lactiplantibacillus trong môi trường Mgl (có chứa glucose) và L. acidophilus NCFM và L. agilis DSM 20509 biểu hiện OD560max cao hơn sau 24 giờ. Tuy nhiên, các giá trị OD tối đa cũng được quan sát thấy đối với vi khuẩn Lactiplantibacillus khi sử dụng MRSc có giá trị MRS (pH tự do) thấp hơn.
Khi các thông số sinh trưởng được tính toán từ số lượng khuẩn lạc (CFU/mL) thu được bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa, Lactiplantibacillus cho thấy mức tăng trưởng cao nhất (>109 CFU/mL) khi được cấy vào môi trường Mgl, Mlac, MRS và MRSc, mức sinh trưởng thấp hơn trong môi trường Mw và Msm trong khi mức tăng trưởng kém hơn trong môi trường Mpep. Số lượng tế bào cao nhất đạt được trong Mgl (L. plantarum 1582 và L. acidophilus NCFM), Mlac (L. plantarum 1582, L. plantarum JDM1 và L. agilis DSM 20509) và MRS (L. plantarum 1582 và L. acidophilus NCFM).
Từ kết quả của nghiên cứu này, Mlac (g/L: sữa gầy, 10; chiết xuất nấm men, 10; lactose, 30) và Mgl (g/L: chiết xuất nấm men, 20; glucose, 10) cho thấy điều kiện tốt để sản xuất bán công nghiệp hoặc công nghiệp các loại lợi khuẩn Lactiplantibacillus sử dụng cho chăn nuôi đã chọn. Sự hiện diện của natri axetat trong môi trường Mgl, một thành phần của môi trường MRS thương mại, được báo cáo là nguồn năng lượng và tác nhân chọn lọc đối với vi khuẩn Lactiplantibacillus (Stiles et al., 2002). Mặt khác, môi trường cô đặc protein whey (protein, 78%; carbohydrate, 4,5%) (Mw) cũng như môi trường chứa sữa gầy (Msm), một nguồn nitơ (casein, ~ 35%) và carbon (lactose, ~ 50%) tương ứng không thể tạo ra sinh khối vi khuẩn Lactiplantibacillus cao. Kết quả này không phù hợp với lợi thế về kinh tế và tăng trưởng của môi trường nuôi cấy dựa trên sữa gầy được sử dụng để sản xuất sinh khối Lactiplantibacillus (Kusnadi & Afriyan, 2012).00
Trùng hợp với kết quả tìm thấy khi đo OD, sản lượng sinh khối thấp nhất của các chủng Lactiplantibacillus được chọn thu được trong môi trường chứa casein peptone (Mpep), L. plantarum 1582, L. plantarum JDM1 và L. agilis DSM 20509 cho thấy giá trị CFU/mL tối đa thấp hơn. Riêng đối với L. acidophilus, Olson and Aryana (2012)) đã báo cáo sự giảm tăng trưởng khi có peptone so với sữa gầy, tương tự với kết quả từ nghiên cứu này. Môi trường nuôi cấy biến tính bao gồm chiết xuất nấm men, glucose và natri axetat/natri glutamat là các thành phần chính, loại bỏ peptone (nguồn nitơ đắt tiền) đã được sử dụng để sản xuất sinh khối bằng các chủng L. plantarum có mục đích sử dụng làm chế phẩm sinh học (Hwang et al., 2011). Môi trường tối ưu chứa các chất thải nông nghiệp – công nghiệp như váng sữa phô mai, chiết xuất nấm men công nghiệp, dịch ngâm ngô, bột đậu nành và mật mía cùng nhiều loại khác đã được thử nghiệm để sản xuất sinh khối vi khuẩn Lactiplantibacillus (Hwang et al., 2011; Manzoor et al., 2017).
Kiểm chứng điều kiện tối ưu trên thiết bị lên men bán công nghiệp
Hỗn hợp 4 chủng Lactiplantibacillus đã được định danh được nuôi trên thiết bị 30 L chứa 20 L môi trường và môi trường nuôi cấy có chứa glucose và bột sữa gầy (Mgl và Mlac), ở 37oC, với 5% tiếp giống, thời gian 24 giờ. Sinh khối tăng đáng kể từ 0,49 đến 0,64 g/L đến khi tăng tốc độ khuấy từ 10 đến 50 vòng/phút và có xu thế giảm nhẹ xuống còn khoảng 0,6 g/L khi tăng cao hơn. Như vậy, tốc độ khuấy thích hợp cho sự sinh trưởng của các chủng lợi khuẩn là 50 vòng/phút. Tốc độ khuấy có vai trò lớn đối với sinh trưởng của các vi sinh vật khi nuôi trong các thiết bị lên men, nó vừa có tác dụng đảo trộn môi trường vừa giúp phân tán đều dinh dưỡng tiếp xúc với bề mặt, làm tăng khả năng hấp thụ dinh dưỡng của tế bào. Sinh khối vi khuẩn tăng đáng kể từ 0,49 đến 0,64 g/L khi tăng tốc độ khuấy từ 10 đến 50 vòng/phút. Tuy nhiên, việc tăng tốc độ khuấy lên trên 50 vòng/phút lại không làm tăng sinh khối thêm, thậm chí còn có xu hướng giảm nhẹ.
Kết luận
Trong nghiên cứu, 68 chủng vi khuẩn được phân lập từ phân gà bản địa, 5 chủng Lactiplantibacillus (L3, L8, L18, L27 và L36) có khả năng kháng khuẩn cao đối với các mầm bệnh đường ruột trên gà trong nghiên cứu. Điều này an toàn do không có khả năng dung huyết và khả năng kháng kháng sinh thấp. Giải trình tự 16S rRNA xác định 4 trong 5 chủng này là L. plantarum 1582, L. plantarum JDM1, L. acidophilus NCFM và L. agilis DSM 20509. Các chủng này đạt được sinh khối cao nhất khi nuôi cấy trong môi trường chứa glucose và bột sữa gầy (Mgl và Mlac).
Thử nghiệm qua mô hình nuôi cấy bán công nghiệp cho thấy tốc độ khuấy 50 vòng/phút có thể đạt sinh khối cao nhất (0,6 g/l). Như vậy, 4 chủng Lactiplantibacillus được tuyển chọn có tiềm năng sử dụng làm chế phẩm sinh học ở quy mô bán công nghiệp thay thế kháng sinh trong chăn nuôi gà.
(Nguồn: Vụ Khoa học Công nghệ và Môi trường)
